موسسه اطلاعات مرغداری - تشخیص برونشیت عفونی: نگاهی کلی بر مفاهیم

دكتر فاطمه پورصفر، دكتر آرش قليان چي لنگرودي

دوماهنامه دنياي كشت و صنعت، شماره 71، ارديبهشت و خرداد 1391 ص 20 , 7 مرداد 1391 ساعت 8:23

خلاصه: برونشیت عفونی باعث ایجاد عفونت چند سیستمی با علائم مشابه ایجاد شده توسط سایر پاتوژنها میگردد و بنابراین دقت بالای تشخیصی، تنها میتواند توسط طیفی از سنجش های آزمایشگاهی به دست آید. این مقاله به صورت مختصری آزمایشهای ویروس شناسی سنتی مانند تلقیح جنین، حلقه های نایی و آزمایشهای خنثی سازی ویروس جهت ردیابی مستقیم ویروس برونشیت عفونی پرندگان و روشهای مبتنی بر بیولوژی مولکولی ژن و برخی از آزمایشها برای ردیابی آنتی بادی های ضد ویروس برونشیت عفونی شامل ELISAرا مرور می نماید.در مورد هر تکنیک، نگاهی منتقدانه توسط نویسنده آماده شده است.

دكتر فاطمه پور صفر (دانش آموخته دانشكده دامپزشكي دانشگاه تهران)
دكتر آرش قليان چي لنگرودي (استاديار دانشكده دامپزشكي دانشگاه تهران)

مقدمه:
از سال 1931، برونشیت عفونی طیور میتواند به عنوان یک بیماری واگیردار عفونی که عمدتا سیستم های کلیوی، تولید مثلی و روده ای مرغان مادر، تخم گذار و گوشتی را متاثر میکند و توسط تیپ های متنوع ویروس برونشیت عفونی منتشر در سراسر دنیا ایجاد میشود تعریف گردد. اهمیت برونشیت عفونی در ارتباط با خسارات اقتصادی به وسیله کاهش تولید تخم، کیفیت نامطلوب داخلی و خارجی تخم مرغ، وجود تخم گذاران خاموش، ناباروری، تاخیر رشد، افزایش استعداد ابتلا به عفونت های ثانویه و در برخی موارد مرگ و میر متوسط تا شدید مشخص میشود.
تشخیص آزمایشگاهی:
اگر چه ویروس IB ویروسی است که باعث خسارات اقتصادی قابل توجه در طیور میگردد، اما علائم آن اختصاصی نیستند. بنابراین هنگامی که مشکلات بالینی در فیلد وجود دارد، استفاده از ابزار جهت شناسایی ویروس برونشیت عفونی لازم است. به طور کلی این بیماری میتواند به وسیله ردیابی خود ویروس(یا بخش هایی از آن) یا توسط پاسخهای اختصاصی آنتی بادی تشخیص داده شود. انتخاب بهترین آزمایش تشخیصی و تفسیر متعاقب آن ممکن است بسیار مشکل و گیج کننده باشد. طبق پیشنهاد Dewit در سال 2000، فاکتورهایی که ردیابی موفق ویروس برونشیت عفونی را تحت تاثیر قرار میدهند عبارتند از:
الف) زمان سپری شده بین شروع عفونت و نمونه گیری: دستگاه تنفس فوقانی مکان اولیه تکثیر ویروس برونشیت عفونی است که متعاقب آن ویرمی اتفاق می افتد و باعث میشود که ویروس به سایر بافتها منتشر شود. تمام تیپ های ویروسهای IB میتوانند از دستگاه تنفسی فوقانی جدا شوند که بالاترین غلظت آن در نای، طی 5-3 روز اول بعد از عفونت میباشد. بعد از این دوره تیتر ویروس به سرعت در هفته دوم پایین آمده و به زیر سطوح قابل ردیابی می رسد.
یک فاکتور پیچیده کننده از نقطه نظر تشخیصی این است که کدام ارگانها و چند پرنده، حاملان ویروس هستند(از منشاء واکسن یا فیلد). برای جداسازی طولانی مدت یا دفع معکوس ویروس تلقیح شده، توضیحات منطقی مانند عفونت متقاطع مستمر در بین گله های آلوده یا واکسینه شده وجود دارد. دو مکان اصلی مداومت ویروس، لوزه های سکومی و کلیه میباشند.
ب) سطح ایمنی مرغ در زمان آلودگی: سطح ایمنی اکتسابی در زمان عفونت بالاترین تاثیر را بر روی دوره و تعداد ویروس IB قابل ردیابی دارد. حضور آنتی بادی های مادری، سطح دوباره جداسازی ویروس عرضه شده در نای و کلیه جوجه های 2 روزه، بعد از رویارویی با ویروس را کاهش نمیدهد.
پ) تعداد مرغهای نمونه گیری شده: اخذ نمونه های کمتر از تعداد مورد نیاز، شانس ردیابی عفونت ویروس برونشیت عفونی را کاهش میدهد.
ت) انتخاب ارگانها(نمونه ها): هنگامی که علایم تنفسی حاد، برجسته میباشد مکان ارجح برای جمع آوری نمونه دستگاه تنفسی است. کلیه ها، لوزه های سکومی و کلوآک ترجیحا هنگامی نمونه برداری میشوند که عفونت های مزمن یا عفونت هایی در مرغهای واکسینه شده مانند تخم گذارها و مادرها وجود دارد که وجود مقدار کمی ویروس در دستگاه تنفسی مورد انتظار است.
ث) کیفیت نمونه: برای حفظ و ماندگاری ویروس، نمونه ها باید به سرعت سرد شوند. اگر فریز کردن یا سرد کردن ممکن نیست، نمونه ها باید در گلیسیرین 50 درصد که ویروس IB برای چندین روز در آن زنده میماند قرار داده شوند.
ج) ژنتیک پرنده: چندین مطالعه نشان میدهد که جنبه های ژنتیک ممکن است حساسیت به ویروس IB را تحت تاثیر قرار دهند. لاین های مختلفی از مرغها مرگ و میر مختلفی بعد از تلقیح تنها ویروس IB یا با عفونت همزمان با اکلای نشان میدهند.
چ) جداسازی ویروس(تکثیر و ردیابی ویروس IB): جداسازی ویروس میتواند پر زحمت، زمان بر و گران قیمت باشد. علاوه بر آن، روش کلاسیک جداسازی ممکن است نیاز به چندین پاساژ در تخم مرغهای جنین دار داشته باشد تا مرگ و میرجنینی اتفاق افتد یا سایر علائم در جنین ها ردیابی شود.
برونشیت عفونی یکی از مهمترین علل زیان های اقتصادی در فارمهای طیور است و ممکن است مربوط به مشکلات تنفسی، نفریت و کاهش تولید و کیفیت تخم مرغ باشد. اگرچه این علائم اختصاصی IB نیستند و بنابراین برای شناسایی عفونت های مربوط به IB در هنگامی که مشکلات بالینی در فیلد مشاهده میشوند، ابزارهای تشخیصی لازم میباشند. این ابزارهای تشخیصی ممکن است شامل طبقه بندی تیپ های شناسایی شده در طول مدت جداسازی، به منظور انتخاب برنامه واکسیناسیونی که بهترین حفاظت از گله ها را تامین کند باشد.
مروری بر تکنیک های تشخیصی قابل انجام برای IB میتواند در Di Fabio و Villarreal یافت شود.
تشخیص غیر مستقیم:
ردیابی آنتی بادی:
عفونت های ویروس برونشیت عفونی میتواند به وسیله ردیابی یا افزایش تیترهای آنتی بادی اختصاصی ویروس IB تشخیص داده شوند. به طور کلی نمونه گیری دوتایی(جفت) سرم برای برقراری ارتباط بین مشکل بالینی با عفونت ویروس IB ضروری است. اولین نمونه در شروع بیماری و دومین نمونه، 4 هفته بعد جمع آوری میشود.برخی از عوامل ممکن است موفقیت ردیابی آنتی بادی ویروس IB را تحت تاثیر قرار دهند مانند: سن زمان آلودگی یا واکسیناسیون( درجه پاسخ ایمنی هومورال بعد از عفونت یا واکسیناسیون، هنگامی که عفونت در سن بسیار پایین اتفاق می افتد ممکن است کاهش یابد؛ زیرا بسیاری از جوجه ها هنوز دارای ایمنی کافی نمی باشند)؛ حضور آنتی بادی مادری در زمان آلودگی یا واکسیناسیون( این مورد ممکن است پاسخ سرولوژی به واکسیناسیون یا آلودگی را به تاخیر اندازد؛ حضور ایمنی در زمان آلودگی یا واکسیناسیون( حساسیت تست ها برای ردیابی آنتی بادی ها در مرغهای واکسینه شده در مقایسه با مرغهای غیر واکسینه ممکن است پایین تر باشد)؛ تعداد مرغهای مورد نمونه گیری(تعداد مرغهایی که باید برای ردیابی تغییر تیتر سرمی نمونه گیری شوند بستگی به شیوع بیماری و حساسیت تست دارد)؛ واکنش های متقاطع بین سروتیپ ها و وقوع تیپ های جدید و غیر قابل انتظار ویروس IB.
ELISA:
الایزا یک روش ایمونوآنزماتیک است و اتوماسیون آن، ردیابی و تیتراسیون آنتی بادی ها در تعداد زیادی از نمونه های سرم را ممکن میسازد. اکثریت تست های الایزای ویروس برونشیت عفونی، عمومی میباشند. به عبارت دیگر آنها سروتیپ ها را از هم متمایز نمی کنند. این به علت این حقیقت است که سطح پلیتی که واکنش آنتی ژن-آنتی بادی در آن اتفاق می افتد با سوسپانسیون ویروسی به شکل کامل آن تلقیح شده است. هنگامی که هرگونه سویه ویروس IB وجود داشته باشد واکنش مثبت است. الایزا، IgG را شناسایی میکند و بنابراین شاخص ایمنی هومورال است و آنالیز پاسخ های بعد واکسیناسیون و عفونت را ممکن میسازد(در پرندگان بالغ).
آزمایش خنثی سازی ویروس:
این آزمایش، آنتی بادیهای تولید شده علیه قطعه پروتئین S1 را ردیابی میکند و بنابراین یک آزمایش اختصاصی سروتیپ میباشد. این آزمایش میتواند در کشت های سلولی یا در کشت های حلقه نای انجام شود. قرائت آن، همان اصول مشابه جداسازی ویروس در تخم مرغهای جنین دار، کشتهای سلولی و کشت های حلقه نای را دارد. به عبارت دیگر، این آزمایش، تغییرات جنینی، اثر سایتوپاتیک و سیلیواستازیس را شناسایی میکند. این آزمایش نیاز به سرم بدون واکنش متقاطع با سایر سروتیپها دارد. آنتی بادیهای خنثی کننده بسیار اختصاصی بوده و مسئول اثر محافظت کننده سرم میباشند. آنها آنتی ژنهای مهم سطح ویروس را که نقش مهمی در فرایند جذب سلولی دارند مورد هدف قرار میدهند. یک زیان این آزمایش، فقدان استانداردسازی در بین سیستم های مختلف خنثی سازی ویروس است و مقایسه نتایج در بین آزمایشگاههای مختلف را مشکل میسازد.
ایمونودیفیوژن در ژل آگار:
این آزمایش نیاز به قطعات زیادی از تجهیزات یا امکانات رفاهی اختصاصی دارد. این آزمایش، برای تمایز باندهای رسوبی غیر اختصاصی از باندهای رسوبی اختصاصی ویروس IB، نیاز به تضمن یک سرم کنترل مثبت دارد. اگرچه این آزمایش کاملا ساده است، اما برای برونشیت عفونی استانداردسازی نشده است.

آزمایش ممانعت از هماگلوتیناسیون:
ویروس IB به صورت طبیعی خاصیت هماگلوتیناسیون ندارد و برای آشکار سازی هماگلوتینین، نیاز به یک تیمار اولیه با آنزیم فسفولیپاز تیپ C دارد که این امر باعث میشود این آزمایش برای انجام دادن و استاندارد سازی مشکل شود. آنتی بادیهای ممانعت کننده از هماگلوتیناسیون در ابتدا بر علیه پروتئین S1 القاء میشوند. آزمایش HI معمولا اولین آنتی بادی ها را بین هفته های یک و دو بعد از آلودگی ردیابی میکند. تست HI هنگامی که برای ردیابی آنتی بادیها بعد از یک تلقیح منفرد استفاده میشود، اختصاصی سروتیپ است. اختصاصیت سروتیپی HI بعد از عفونت مجدد ویروس IB بسیار پایین تر است؛به خصوص زمانی که دومین سروتیپ یا سروتیپ بعدی ناهمگون هستند.
تشخیص مستقیم:
جداسازی در تخم مرغهای جنین دار:
اثرات مشخصه ایجاد شده توسط ویروسIB در تخم مرغهای جنین دار، قدیمی ترین علامت ها برای تشخیص ویروس میباشند و از زمان شروع مطالعات روی IB با موفقیت استفاده شده اند. این اثرات، شامل کوتولگی جنین، پیچش، خونریزی و مرگ میباشد. ضایعات مطابق نمونه یا تیپ متغیر است و شدت آنها با افزایش تعداد پاساژهای تخممرغ افزایش می یابد. در این آزمایش، تخم مرغهای جنین دار 10-9 روزهبا 0.2-0.1 میلی لیتر از یک نمونه فیلدی در حفره آلانتوئیک تلقیح میشوند.(ارگانها، محتویات روده ای و سوآب های نایی و کلوآک همگی به صورت سوسپانسیون آماده میشوند؛ آنتی بیوتیکها اضافه میشوند و در داخل غشاهای پرمنفذ فیلتر میشوند) و مجددا برای یک دوره تا 4 روزه تلقیح میشوند. سپس مایعات آلانتوئیک جمع آوری شده و دوباره پاساژ داده میشوند و سپس جنین ها از لحاظ مورفولوژی آنالیز میگردند. بیشترین تیتر ویروس IB، یک تا دو روز بعد از تلقیح ایجاد میشود( به جز برای نمونه هایی که به تخم مرغهای جنین دار آداپته شده اند).
تخم مرغ جنین دار یک مدل موثر برای جداسازی ویروس IB نمونه های فیلد است، زیرا میتواند برایبیشتر سویه های فیلد استفاده شود؛ اگرچه زیان آن اینست که معمولا 3 پاساژ پی در پی برای ایجاد ضایعات مشخص در جنینها مورد نیاز است که تشخیص را به تعویق می اندازد. علاوه بر آن جداسازی در تخم مرغها ممکن است کاهش یابد، برای مثال وقتی که ویروس IB به علت نگهداری نامناسب غیرفعال میشود. علت محتمل دیگر برای شکست در جداسازی ویروس، آلودگی همزمان با سایر ویروسهایی است که از تکثیر ویروس IB در جنین ها جلوگیری میکنند. علاوه بر آن اگر ویژگی بالاتر مورد نیاز باشد، یک تست تاییدی مانند خنثی سازی ویروس یا RT-PCR باید انجام شود.
کشت در حلقه های نای:
این تکنیک ار حلقه های نای جنین های SPF در روزهای 19 تا 20 انکوباسیون استفاده میکند. حلقه های به دست آمده از نای های جنین، به صورت مجزا در داخل لوله های آزمایش حاوی محیط کشت سلول و آنتی بیوتیک قرار داده میشوند و به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد در یک سیستم کشت در حال چرخش انکوبه میگردند و تنها حلقه های با حرکت مژه بیش از 50 درصد استفاده میشوند. بعد از این دوره، محیط کشت دور انداخته شده و 0.1میلی لیتر از سوسپانسیون نمونه مورد آزمایش اضافه میگردد و تا 1 ساعت انکوباسیون، برای جذب ویروسی پیگیری میشود. سپس 1 میلی لیتر از محیط کشت اضافه میگردد و نمونه مجددا انکوبه میشود.در 24، 48، 72 و 96 ساعت بعدازتلقیح،حلقه های نای درمیکروسکوپ معکوس چشمی مشاهده گردیده وحرکت مژههاارزیابی میشودکه بایدباتوجه به تکثیرویروس کاهش یابد.
اگرچه این روش، یک روش موثر پیشگیری کننده است، زیان آن حساس نبودن برای نمونه های فیلدی ویروس IBاست که تمایلی برای دستگاه تنفسی ندارند و بنابراین ممکن است منجر به نتایج کاذب شود.
روشهای مبتنی بر نوکلئیک اسید:
ردیابی ویروس IB مبتنی بر حضور RNA اختصاصی ویروس با تکنیک RT-PCR در سالهای اخیر افزایش یافته است. زیرا دقت آن برای تشخیص و دسته بندی تیپها بالاست. هزینه های پایین انجام و اجرای آن به تعداد زیادی از آزمایشگاههای عمومی و خصوصی امکان استفاده روتین آن را داده است. به طور خلاصه، تکنیک RT-PCR در ابتدا با استفاده از DNA های کاوشگر کوچکی به نام پرایمر، از RNA ویروس IB، DNA تولید میکند. DNA تولید شده که مولکول DNA مکمل نامیده میشود بیلیونها بار توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز تکثیر میشود و تولید یک قطعه DNA دو رشته ای می نماید که با تعداد جفت بازهای محدود شده به وسیله پرایمر اندازه گیری میگردد و پس از آن، قطعه DNA اختصاصی توسط الکتروفورز ردیابی میشود.

به منظور انجام تشخیص اسکرینینگ با استفاده از RT-PCR، مناطق ژنومی ای که در نوع خاصی از پاتوژنها بسیار محافظت شده است باید انتخاب شوند تاپرایمرهاشروعبهتکثیر توالی های خاص موجود در تیپ های بسار متنوع نمایند. در مورد ویروس IB، مناطقی از ژنومکه معمولا برای تشخیص اسکرینینگ استفاده میشوند ژنی است که نوکلئوپروتئین را به رمز در آورده و منطقه ای که در انتهای ژنوم ویروس IB واقع شده که هیچ پروتئینی را رمز نمیکند اما در رونویسی ژنوم ویروس نقش دارد و منطقه'3- ترجمه نشده(3’ UTR) نام دارد. به عبارت دیگر، RT-PCR هایی که از این مناطق به عنوان هدف استفاده میکنند قادرند که هرگونه سروتیپ یا ژنوتیپ ویروس IB را تشخیص دهند. اگرچه این اجازه تمایز بین نمونه ها یا سویه های ویروس IB را نمیدهد که برای تمایز آن نیز نیاز به انتخاب منطقه ای است که امکان ردیابی تفاوت ها در بین این نمونه ها را فراهم آورد. در این مورد، ژن گلیکوپروتئین اسپایک S، که اختصاصی هر سروتیپ و ژنوتیپ است میتواند استفاده شود، زیرا این پروتئین بیشترین فشار انتخاب از سوی سیستم ایمنی را متحمل میشود. بنابراین میتوان در RT-PCR برای ردیابی اختصاصی هر تیپ ویروس IB از پرایمرهایی که ژن اسپایک را هدف قرار میدهند یا آنهایی که با تولید DNA، اجازه تمایز به وسیله توالی یابی DNA را فراهم میکنند استفاده نمود. اگرچه RT-PCR یک روش بسیار حساس و اختصاصی است، آزمایشهای تشخیص ویروسی سنتی و مرجع نیز نباید کنار گذاشته شوند. همراهی نتایج به دست آمده با استفاده از تکنیک های مختلف امکان تشخیص دقیق تر و درست تر را فراهم می آورد. بعلاوهRT-PCR، قادر به تفکیک ویروسهای عفونی از غیرعفونی نمیباشد.

Villarreal LYB ,2010, Diagnosis of Infectious Bronchitis: An Overview of Concepts and Tools, Workshop: Infectious Bronchitis (IB) in the Brazilian Poultry Industry